Durante los próximos 200 años, la Iglesia Católica Romana, sobre todo los ascetas y simples miembros de la Sociedad de Jesús (los jesuitas), tenía mucho más influencia en la vida social y económica de la colonia que los flojos gobernadores que sucedieron a Irala y a Hernandarias. Tres jesuitas, un irlandés, un catalán y un portugués, llegaron en 1588 desde el Brasil. Se marcharon rápidamente de Asunción para promoverse entre los indios a lo largo del curso superior del río Paraná. Los guaraníes como ya creían en un ser impersonal y supremo con anterioridad, demostraron ser buenos alumnos de los jesuitas.

En 1610 Felipe III (1598-1621) proclamó que sólo "la espada de la palabra" debe usarse para dominar a los indios paraguayos y de esa forma ellos serían personas felices. La Iglesia le concedió poderes extensos al padre jesuita Diego de Torres para poder llevar a cabo un nuevo plan con bendiciones reales que se preveía el fin del sistema de la encomienda. No les gustó para nada este plan a los colonos cuyo estilo de vida dependía de la incesante labor india. La resistencia de los colonos convence a los jesuitas de mudar su base de actividades a la provincia de Guairá en el distante sudeste. Después de esfuerzos infructuosos para civilizar a los recalcitrantes guaycurúes, los jesuitas pusieron esta vez todos sus esfuerzos en el futuro en trabajar con los guaraníes. Distribuyendo a los indios guaraníes en "reducciones" (municipios), los empeñosos padres empezaron un sistema que duraría más de un siglo. En uno de los más grandes experimentos de vida comunitaria en la Historia, los jesuitas habían organizado aproximadamente 100.000 guaraníes en unas veinte reducciones y prontamente soñaron con un imperio jesuítico que abarcaría desde la confluencia de los ríos Paraguay y Paraná hasta las cabeceras del río Paraná. Sin rangos fijos en su sociedad, la comunidad como único fin, la labor de esos jesuitas es interpretada como una república comunista, tal vez la primera en su género en el mundo.

Las nuevas reducciones jesuíticas estaban desgraciadamente dentro de la zona de saqueo de los bandeirantes, gente que recluta esclavos y que desciende de una mezcla de portugueses y aventureros holandeses. Empleaban ejércitos de "mamelucos" (mestizos de negros e indios), pobres infelices a quienes los lanzaban al frente en las aventuras más riesgosas. Los bandeirantes tenían por base en San Pablo, Brasil que se había vuelto un asilo para los saqueadores y piratas por los primeros años del siglo XVII porque estaban fuera del control del gobernador colonial portugués. Sobrevivían capturando a los indios y vendiéndolos como esclavos a los plantadores brasileños. Habiendo vaciado la población india cerca de San Pablo, Brasil, se aventuraron aún más lejos de casa dando con el hallazgo de las reducciones ricamente pobladas. Las autoridades españolas escogieron no defender los lugares jesuitas.

España y Portugal se fusionaron en un solo reino de 1580 a 1640. Aunque sus asuntos coloniales estaban sujetos en actos de guerra, el gobernador del Río de la Plata tenía muy poco incentivo para enviar escasas tropas y suministros contra un enemigo que era nominalmente de la misma nacionalidad. Además, los jesuitas no eran populares en Asunción donde los colonos tenían asegurado su control sobre el gobernador de turno. Los jesuitas y sus neófitos tenían así muy poca protección de las depredaciones de los paulistas (asi llamados a los bandeirantes por su proveniencia de San Pablo). En una correría en 1629, aproximadamente 3.000 paulistas destruyeron reducciones que encontraron en su camino quemando iglesias, matando a ancianos y niños (quienes carecían de valor como esclavos) y llevando a cabo a la costa las poblaciones humanas enteras, así como el ganado. Sus primeras correrías contra las reducciones les redituaron por lo menos unos 15.000 cautivos.

De cara ante el imponente desafío de un virtual holocausto que estaba asustando a los neófitos que los inducía volver al paganismo, los ingeniosos y valientes jesuitas tomaron medidas drásticas. Bajo la dirección del padre Antonio Ruiz de Montoya, algo más de 30.000 indios (2.500 familias) se retiraron usando canoas viajando centenares de kilómetros hacia el sur para el lado de otra gran concentración de reducciones jesuíticas cerca del curso más bajo del Paraná. Aproximadamente 12.000 personas lograron sobrevivir. Pero la retirada no detuvo a los paulistas que continuaron haciendo una incursión más en la cual casi extinguían esas reducciones. La amenaza de los paulistas sólo se acabó luego de 1639, cuando el virrey en Perú permitió a los indios armarse. Bien entrenados y altamente motivados por los jesuitas las unidades indias derrotó a lo grande a los invasores y se los expulsó.

La aplastante victoria sobre los paulistas inauguró la edad dorada de los jesuitas en el Paraguay. Los guaraníes estaban desacostumbrados a la disciplina y la vida sedentaria prevalecientes en las reducciones pero se adaptaron fácilmente a ambas cosas ya que se les ofrecían normas vivientes más altas, protección de los crueles e insensibles colonos asuncenos y la seguridad física. Ya en 1700 los jesuitas podían contar 100.000 neófitos en aproximadamente 30 reducciones. Las reducciones exportaban materias primas y productos variados incluyendo algodón y tela de lino, cueros, tabaco y principalmente la yerba mate (una infusión como el té pero más amargo que es muy popular en Paraguay, Argentina, Uruguay y el sur del Brasil). Los jesuitas también levantaron reservas de comida y enseñaron artes y destrezas. Además pudieron dar un servicio considerable a la corona proporcionando ejércitos indígenas contra los ataques perpetrados por portugueses, ingleses y franceses. En el momento de la expulsión de los jesuitas del Imperio español en 1767, las reducciones eran enormemente ricas y comprendían más de 21.000 familias. Sus inmensas manadas incluían aproximadamente 725.000 cabezas de ganado, 47.000 bueyes, 99.000 caballos, 230.000 ovejas, 14.000 mulas y 8.000 asnos.

Debido a su éxito, los 14.000 jesuitas que se ofrecían voluntariamente para servir en Paraguay, se ganaron muchos enemigos. Estos hombres de Dios eran una fea espina en el ánimo de los colonos quienes los veían con ojos envidiosos y resentidos. Luego propalaron rumores sobre minas de oros ocultos y la amenaza a la Corona proclamando una presunta república jesuítica independiente en un futuro corto. Pero para la Corona, las reducciones eran como una manzana que se iba madurando y esperando para ser recogida.

Las reducciones fueron presa de los tiempos cambiantes. Entre los años 1720 y 1730, los colonos paraguayos se rebelaron contra los privilegios jesuitas y el gobierno que los protegía. Aunque esta revuelta falló, era una de las más virulentas contra la autoridad española en el Nuevo Mundo y provocó en la Corona la duda sobre la conveniencia de seguir apoyando a los jesuitas. La Guerra de las Siete Reducciones (1750-61) que se libró para evitar la entrega de siete misiones al sur del río Uruguay al control portugués ocasionó el sentimiento en Madrid de que debería suprimir "el imperio dentro de un imperio".

En un movimiento para adjudicarse las riquezas de las reducciones para ayudar a las decaídas finanzas de la Corona, el rey español, Carlos III (1759-88), expulsó a los jesuitas en 1767. Después de unas décadas de la expulsión, la mayoría de todo lo bueno que los jesuitas habían hecho se desperdició. Las misiones perdieron su valor, se administraron mal y fueron abandonadas por los guaraníes. Los jesuitas casi desaparecieron sin rastro. Hoy día, unas ruinas cubiertas por el musgo es el único testimonio de ese largo y variado periodo de 160 años de la Historia paraguaya.

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